PrimerPlex 软件：等位基因特异性引物延伸（ASPE）检测设计

ASPE 技术概述

等位基因特异性引物延伸（Allele Specific Primer Extension，ASPE）是一种基于溶液的序列特异性酶促反应技术，可在单个反应管中同时检测多个 SNP。ASPE 方法包含两个阶段：首先通过酶促反应确定目标基因型，随后在固相微球表面进行捕获以实现检测。借助溶液相动力学优势，该技术可利用序列标记的微球来检测新模板，具体实现方式是在等位基因特异性寡核苷酸上连接适当的捕获序列。

可使用 AlleleID® 软件设计用于菌株区分和 ASPE xMAP® 检测的方案。

等位基因特异性引物设计指南

1. ASPE 引物应来自同一 DNA 链（针对每个目标序列），并为所有序列变体合成相应引物。

2. 建议退火温度（Ta opt）应在 51–56°C 范围内。

3. SNP 位点应位于等位基因特异性引物的 3' 末端，以确保准确的杂交。

4. 捕获序列（TAG 序列）应位于引物的 5' 末端。

ASPE 反应的模板为扩增后的 PCR 片段。生成该片段时不需要对引物进行标记。在等位基因特异性引物延伸步骤中，聚合酶通过掺入生物素标记的 dNTP 来延伸引物。只有当等位基因特异性引物的 3' 末端与同源等位基因序列结合时，才会发生延伸。

该 SNP 基因分型检测的反应条件取决于连接在荧光微球上的抗 TAG 序列。微球内部标记有荧光染料，并与抗 TAG 序列偶联。

等位基因特异性寡核苷酸的设计可参照本文概述的检测设计指南，或使用 PrimerPlex 软件工具——该工具专为基于 xMAP 系统的多重分析设计 ASPE 检测而开发。